惡性瘧原蟲(chóng)/間日瘧原蟲(chóng)探針?lè)╭PCR試劑盒
產(chǎn)品及特點(diǎn)
瘧原蟲(chóng)，是一類(lèi)單細(xì)胞、寄生性的原生動(dòng)物。有四種瘧原蟲(chóng)會(huì)使人類(lèi)感染瘧疾，包括惡性瘧原蟲(chóng)（Plasmodium falciparum）、間日瘧原蟲(chóng)（Plasmodium vivax）、三日瘧原蟲(chóng)（Plasmodium malariae）和卵形瘧原蟲(chóng)（Plasmodium ovale） 。這些瘧原蟲(chóng)有蚊蟲(chóng)和人兩個(gè)宿主，包括蚊體內(nèi)的有性繁殖和人體內(nèi)的無(wú)性增殖，攜帶瘧原蟲(chóng)的按蚊通過(guò)叮咬人而傳播，引起瘧疾寒熱往來(lái)發(fā)作，俗稱(chēng)“打擺子”。我國(guó)主要以惡性瘧原蟲(chóng)和間日瘧原蟲(chóng)感染為主，偶爾有傳入性的三日瘧原蟲(chóng)和卵形瘧原蟲(chóng)感染。因此快速檢測(cè)惡性瘧原蟲(chóng)和間日瘧原蟲(chóng)在我國(guó)具有重要的意義。本產(chǎn)品就是以探針?lè)╭PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)的同時(shí)檢測(cè)惡性瘧原蟲(chóng)和間日瘧原蟲(chóng)的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：
1. 即開(kāi)即用，用戶只需要提供樣品DNA模板。
2. 能在一管中同時(shí)檢測(cè)兩種病原，分別發(fā)出FAM和HEX熒光信號(hào)。
3. 引物和探針經(jīng)過(guò)優(yōu)化，分析靈敏性高，可以分別達(dá)到100拷貝/μL。
4. 提供兩種陽(yáng)性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。
5. 特異性高，引物是根據(jù)惡性瘧原蟲(chóng)和間日瘧原蟲(chóng)DNA高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他生物的DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
6. 既可用于定性檢測(cè)，又可用于定量檢測(cè)。用于定量檢測(cè)時(shí)線性范圍至少為5個(gè)數(shù)量級(jí)。
7. 本產(chǎn)品足夠50次20μL體系的探針?lè)晒舛縋CR反應(yīng)。
8. 本產(chǎn)品只能用于科研。
規(guī)格及成分
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成分
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規(guī)格
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包裝
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2×Probe qPCR MasterMix
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0.5mL
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0.5mL本色管
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熒光PCR專(zhuān)用模板稀釋液
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1mL
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1.5mL綠蓋管
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超純水
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1mL
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1.5mL藍(lán)蓋管
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惡性瘧原蟲(chóng)/間日瘧原蟲(chóng)qPCR引物-探針混合液
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50次
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1.5mL棕色管
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惡性瘧原蟲(chóng)qPCR陽(yáng)性對(duì)照(1×10E7拷貝/μL)
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50μL
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0.5mL黃蓋管
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使用手冊(cè)
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1份
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無(wú)
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本產(chǎn)品采用五孔盒包裝
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使用方法
稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品以10E1-10E6拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例
本產(chǎn)品提供兩種陽(yáng)性對(duì)照，故如有必要，可以做兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供無(wú)傳染性的DNA片段作為陽(yáng)性對(duì)照。
1. 標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為6，5，4，3，2，1。
2. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專(zhuān)用模板稀釋液。
3. 在6號(hào)管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在5號(hào)管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在4號(hào)管中加入5 μL 1×10E5拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E4拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
樣品DNA的制備
7. 如果有N個(gè)樣品，設(shè)置N+2個(gè)提取，多出的一個(gè)是PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照），一個(gè)是NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂?0μL上步所得4號(hào)稀釋液再加上一定量的水使總體積跟核酸制備試劑盒所要求的起始樣本體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。
8. 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)樣品DNA提取試劑盒兼容。也可以選購(gòu)本公司的免提取核酸釋放劑。
Probe qPCR反應(yīng)20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行
9. 如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照（用水做模板），6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+4個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照（用水做模板），1個(gè)用于PCR陽(yáng)性對(duì)照（直接用第6步第4號(hào)管的陽(yáng)性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
數(shù)據(jù)處理
1. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以惡性瘧原蟲(chóng)陽(yáng)性對(duì)照濃度的log值為橫軸，以FAM信號(hào)的Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的FAM信號(hào)Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
2. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照必須FAM信號(hào)無(wú)Ct或Ct大于或等于40。惡性瘧原蟲(chóng)陽(yáng)性對(duì)照必須有FAM熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，F(xiàn)AM信號(hào)Ct值應(yīng)該小于40，否則實(shí)驗(yàn)無(wú)效。如果實(shí)驗(yàn)有效，則分析待測(cè)樣品，如果FAM信號(hào)無(wú)Ct或Ct大于或等于40，則為陰性。如果FAM信號(hào)Ct小于40則為陽(yáng)性。
數(shù)據(jù)處理HEX信號(hào)，對(duì)應(yīng)于間日瘧原蟲(chóng)
3. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以間日瘧原蟲(chóng)陽(yáng)性對(duì)照濃度的log值為橫軸，以HEX信號(hào)的Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的HEX信號(hào)Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
4. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照必須HEX信號(hào)無(wú)Ct或Ct大于或等于40。間日瘧原蟲(chóng)陽(yáng)性對(duì)照必須有HEX熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，HEX信號(hào)Ct值應(yīng)該小于40，否則實(shí)驗(yàn)無(wú)效。如果實(shí)驗(yàn)有效，則分析待測(cè)樣品，如果FAM信號(hào)無(wú)Ct或Ct大于或等于40，則為陰性。如果HEX信號(hào)Ct小于40則為陽(yáng)性。
自備試劑
樣品DNA
運(yùn)輸及保存
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期1年
